ANTİBİYOTİK DUYARLILIK TESTİ

ANTİBİYOTİK DUYARLILIK TESTİ (ANTİBİYOGRAM) UYGULAMA TEKNİKLERİ VE DEĞERLENDİRİLMESİ

BU MAKALE MİSTAV İLAÇ 2009 KEMER/ANTALYA YAZA MERHABA TOPLANTISI’NDA SUNULMUŞTUR.
Giriş:
Gerek insan gerekse hayvan yaşamında antibiyotikler, geçmişte, şu anda ve gelecekte önemini her zaman koruyacaktır.
Alınan tüm hijiyenik tedbirler, temizlik, dezenfeksiyon fumigasyon bazen yetersiz kalmaktadır.
İnsan hareketleri, ekipmanlar, altlık, yem, su, hava, kuşlar, böcek, sinek ve yabani hayvanlar bu hastalık yapan etkenlerin çiftliklerde kümesten kümese, çiftlikten çiftliğe yayılmasına neden olmaktadır.
Antibiyotikler, tedavide en çok kullanılan ve kullanılmasında en çok hata yapılan bir ilaç grubudur. Antibiyotiklere karşı gelişen direnç ve tedaviye yeni antibiyotiklerin girmesi gibi nedenlerle de bilgilerin devamlı yenilenmesi zorunludur.

Antibiyotik kullanımında dikkat edilmesi gereken kurallar:
1- Antibiyotik kullanımının gerekli olması:
Bakteriyel infeksiyon olduğunu kanıtlayabilmek için mikroorganizmanın kültür vasatlarında üretilmesi, izole edildikten sonra serolojik, biyokimyasal testlerle ve bakterinin kültür vasatlarında gösterdiği bazı özelliklere göre özel kültür vasatlarında tekrar üretilerek tanımlanması yapılmalıdır.

2- Uygun antibiyotiğin seçilmesi:
Etkeni belirlemede esas yöntem kültürdür. Antibiyotik tedavisine başlamadan önce mutlaka yapılmalıdır. Kültür ve başka bir laboratuar incelemesi yapma olanağı yok ise; o zaman çok önerilmemekle birlikte genel bilgiler ve verilerden yararlanılır.
Etken bakterinin, antibiyotik duyarlılık durumu nedir? Yanıtlanması gereken ikinci sorudur. Etken izole edilmiş ve tanımlanmışsa, antibiyotik duyarlılık testi yapılarak uygun antibiyotik bulunur.
Disk diffüzyon yöntemi, hızlı üreyen aerob ve fakültatif anaerob bakteriler için önerilen kolay, pratik, standartlara uygun yapılırsa, halen dünyada rutin laboratuarlar için seçilen bir testtir. Antibiyotiğin inhibisyon etkisini ölçen kalitativ bir testtir.

Bilinçsiz ve aşırı antibiyotik kullanımının sakıncaları:
• Direnç gelişimi
• Hastalık tanısının maskelenmesi
• Yüksek maliyet
• Sonuç alınmada gecikme. Hekime ve ilaca güvensizlik.
• Süper infeksiyon ( Dirençli bakterilere bağlı yeni infeksiyon gelişimi)
Antibiyotik tedavisinde başarısızlık:
• Hastalık tanısı doğru değildir
• Mikroorganizma doğru tanımlanmamıştır
• Polimikrobiyal ( aerob- anaerob) infeksiyon vardır
• Bakteri, tedavi sırasında direnç geliştirmiştir
• Süper infeksiyon gelişmiştir
• Antibiyotik infeksiyon yerine ulaşamamaktadır
• Yetersiz doz, yetersiz süre uygulanmıştır
ANTİBİYOTİK DUYARLILIK TESTLERİNDE GÜVENİLİR SONUÇLARIN ALINMASI İÇİN STANDART YÖNTEMLERİN UYGULANMASI ŞARTTIR.
Antibiyogram test için pratikte en yaygın kullanılanı “Disk Diffüzyon” (Kirby-Bauer) yöntemidir.
Belirli bir miktar antibiyotik emdirilmiş kağıt diskler, test mikroorganizmasından hazırlanan standart süspansiyonun yayıldığı agar plakları yüzeyine yerleştirilir.
Böylece diskteki antibiyotik agarın içerisine gittikçe azalan miktarlarda yayılır ve bakteriye etkili olduğu düzeylerde üremeyi engeller. Bunun sonu-cunda disk çevresinde bakterilerin üremediği dairesel bir inhibisyon alanı oluşur (inhibisyon zonu). İnhibisyon zonunun çapı, bakterinin duyarlılığı ile direkt olarak ilişkilidir. Her antibakteriyel için standart değerler vardır. Disk etrafında inhibisyonun görülmemesi, bakterinin o antibakteriyele karşı dirençli olduğunu gösterir.
Bu alanın çapı ölçülerek duyarlı (S), orta duyarlı (I) ve dirençli (R) olacak şekilde duyarlılık dereceleri belirlenir.

KIRBY-BAUER DİSK DİFFÜZYON YÖNTEMİ İLE ANTİBİYOTİK DUYARLILIK TESTİ
1- KOLONİ SEÇİMİ:
Hastalık etkeni olarak izole edilen ve tanımlanan, 18–24 saatlik üremiş olan bakteri kolonilerinden 3-4 tanesi seçilir. Steril koton bir sıvab kullanılması tercih edilir.


2- İNOKULUM SÜSPANSİYONUNUN HAZIRLANMASI:
5 ml’lik tüp içindeki Mueller-Hinton Broth veya Tryptone Soya Broth’a, agardan alınan 3-4 bakteri kolonisi süspanse edilir. Sıvab tüpün dibine daldırılır,karıştırılır ve bu şekilde alınan kolonilerin Broth’a iyice süspanse olması sağlanır. Sıvab tüpün iç cidarlarına bastırılarak çıkarılır.

2 A- Direkt koloni süspansiyonu yöntemi
• Tüm Stafilokoklar
• Zor beğenen, önceden Broth içinde üremesi bilinemeyen Streptokoklar
2 B- Log Faz Büyüme yöntemi
• Bütün organizmalar için bu yöntem kullanılır
• 35° C’de 2-8 saat inkube edilir
• Eğer bulanıklık bu saatler içinde yeterliyse bir üst basamağa geçilir
• Eğer bulanıklık bu saatler içinde yeterli değilse inkubasyona devam edilir

3- İNOKULUMUN STANDARDİZASYONU:
Test süspansiyonunun bulanıklılığı, 2-8 saat üreme sonunda, 0.5 McFarland Standardı ile eşleştirilerek (1.5 x 108 CFU/ml tekabül eden) standardize edilir. Gözle bulanıklık ayarlaması yapılırken hem standardın hem de süspansiyonun çok iyi karıştırıldığına dikkat edilmelidir.
0.5 McFarland Standardının hazırlanması:
0.05 ml % 1.175 Barium Chloride dihydrate (BaCl2. 2 H2O) ile 9.95 ml % 1 sulfuric acid (H2SO4) karıştırılır. Tüplere 5-6 ml olacak şekilde bölünerek buzdolabında saklanır.

a- Her iki yöntemde de Süspansiyon çok yoğunsa;
• Kullanılan Broth’la veya fizyolojik tuzlu su ile tamamlanır, vortex ile karıştırılır
b- Direkt koloni Süspansiyon yönteminde süspansiyon açık renk ise;
• Seçilen kolonilerden ilave edilebilir, vortex ile karıştırılır.
c- Log Faz yönteminde süspansiyon açık renk ise;
• Süspansiyon tekrar inkube edilir, kullanmadan önce vortex ile karıştırılır.

4- PETRİLERE İNOKULUM YAPILMASI:
Steril bir koton sıvab süspansiyonun içerisine daldırılır, karıştırılır. Sıvab tüpün iç kenarına bastırılarak çıkarılır. Agar’ın bir tarafından başlanarak tüm yüzeye yayılır. 60 döndürülerek aynı işlem tekrarlanır. Tekrar 60 döndürülerek aynı sıvab ile aynı işlem yapılır. Dördüncü defa sıvab agar’ın petri kenarlarındaki yüzeyine çepeçevre sürülerek işlem tamam-lanır.
Agar’ın yüzeyinin kuruması için oda ısısında 10-15 dakika beklenir.

5- ANTİMİKROBİYAL DİSKLERİN YERLEŞTİRİLMESİ
Antibiyotik diskleri oda ısısına getirilir. Aynı gruptaki antibiyotiklerin etki mekanizmaları aynıdır. Mümkün olduğu kadar çok sayıda farklı grup antibiyotik diski ile test yapılmalıdır. 150 mm çapı olan petrilere 12 disk, 100 mm olan petrilere 8 diskten fazla yerleştirilmemelidir. Diskler arasında 20 mm mesafe olacak şekilde diskler steril bir pens ile agarın yüzeyine yerleştirilir. Hafifçe üzerlerine pens ile bastırılarak disklerin agarla temasının tam olması sağlanır.
Firmalar tarafından örnek olarak verilen antibiyotik diskleri bu metod ve aynı besi yerleri kullanılarak referens suşlarla valide edilerek spesifize edilmişlerdir.

6- MUELLER-HİNTON BESİ YERİNİN İNKUBASYONU
35° C’de 16 – 18 saat inkube edilir. Aerob olanlar, oksijenli (O2) ortamda, anaerob olanlar ise, jarda % 3-10 karbon dioksit (CO2) veya desikatörde oksijensiz ortam (mum yakarak) sağlamak suretiyle, etüvde üretilirler. Jarda yapıldığı taktirde 90-100 mm çaplı petriler tercih edilmelidir.
7- ZONLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ
Siyah bir zemin üzerinde disklerde dahil olmak üzere zon çapı cetvel ile ölçülür. Disklerle birlikte verilen zon çapları, ölçüm sonrası her bir disk için ayrı ayrı değerlendirilmelidir.

8- SONUÇ
Zon Çapının Tanımlanması:
a- Duyarlı (Susceptible, S)
Enfeksiyonun önerilen dozda o ilaç ile başarılı bir şekilde tedavi edilebileceğini gösterir.
b- Orta derecede Duyarlı (İntermediate, I)
İlacın normalden yüksek dozlarının kullanıldığında klinik olarak etkili olacağını gösterir.
c- Dirençli (Resistant, R)
Tedavide güvenilir bir etkinlik yoktur.
Antibiyotik duyarlılık testlerinin sonuçlarının tekrarlanabilir olması, yani aynı koşullarda tekrarlandığında sonuçların aynı veya birbirine yakın olması gerekir. Testlerin uygun koşullarda yapılıp yapılmadığı, kalite kontrol suşları ile (referens suşlar) denetlenir. Bu suşlarla beklenen sonuçlar elde edilemezse antibiyotik duyarlılık testlerinin tekrarlanması gerekir.
En son olarak:
DOĞRU UYGULANAN VE YORUMU DOĞRU YAPILAN ANTİBİYOGRAM SONUÇLARI KLİNİKTE ANTİBİYOTİK TEDA-VİSİNİN AKILCI OLARAK PLANLANMASINA IŞIK TUTACAKTIR.

EKLER:
1- Tryptone Soya Broth (TSB)
Casein pepton (pancreatic) 17.0 g
Soymeal pepton (pancreatic)  3.0 g
D (+) –Glucose 2.5 g
NaCl  5.0 g
K2HPO4  2.5 g
Distilled Water 1000.0 ml
Distile su içinde kaynatılarak çözülür.
121 derece’de 15 dakika otoklavda sterilize edilir.
Oda ısısına soğutulur. pH 7.3 ± 0.2
Steril olarak, steril tüplere 5 – 6 ml olacak şekilde taksim edilir.
Buzdolabında saklanır.

2- MUELLER-HINTON BROTH
Meat infusion 2.0 g/L
Casein hydrolysate 17.7 g/L
Starh 1.5 g/L
Distilled Water 1000 ml
Distile su içinde kaynatılarak çözülür.
121 derece’de 15 dakika otoklavda sterilize edilir.
Oda ısısına soğutulur. pH 7.3 ± 0.2
Steril olarak, steril tüplere 5 – 6 ml olacak şekilde taksim edilir.
Buzdolabında saklanır.
3- MUELLER-HINTON AGAR
Meat infusion 2.0 g/L
Casein hydrolysate 17.7 g/L
Starh 1.5 g/L
Agar-agar 17.0 g/L
Distilled Water 1000 ml
Distile su içinde kaynatılarak çözülür.
pH 7.3 ± 0.2 (oda ısısında)
121 derece’de 15 dakika otoklavda sterilize edilir.
Otoklav sonrası 45-50 derece’de soğutulup, gerekli ise % 5-10 defibrine kan ilave edilir ve steril petri kutularına yaklaşık 12.5 ml olacak şekilde dökülür.
Oda ısısına soğutulur.
Buzdolabında saklanır.

YARARLANILAN KAYNAKLAR
1- Aksoy, A. Murat ( 2006-2007 ): Bakterilerin İzolasyon ve İdantifikasyon Yöntemleri, Labotatuvar Uygulama Kılavuzu.
2- Türk İnfeksiyon Web Sitesi
3- Gür, Y : Antibiyotik Kullanımında Genel Prensipler.
4- Antimicrobial Susceptibility Testing By CLSI (NCCLS) Reference Disk Diffusion Method (Kirby-Bauer).

KATEGORİLER

HABER ARA

EN ÇOK OKUNANLAR

BUGÜN

DÜN

SON 7 GÜN

BU AY

Bu Yazarın Önceki Yazıları

Son Haberler

SON DAKİKA HABERLERİ

ANKET

SON YORUMLANANLAR